【点成干货】QUANTOM Tx™微生物细胞计数仪助力快速菌群定量分析

QUANTOM Tx™微生物细胞计数仪助力快速菌群定量分析

1 引言

细菌定量是医疗健康、农业生产、食品加工及工业领域的基础检测项目。无论是益生菌中活性干酪乳杆菌的精准计量、疫苗中灭活霍乱弧菌的定量检测、污水处理用硫氧化菌的效能评估，抑或土壤污染监测中的常规菌群分析，乃至实验室标准菌悬液的浓度测定，细菌计数均是关键步骤。本文对比三种传统细菌检测方法，并介绍一种快速自动化定量解决方案。

1.1 菌落计数法

细菌定量的方法之一是统计菌落形成单位（CFUs）。这种广泛使用的方法操作简单，能够很好地反映细胞的活性情况，并且对低浓度细菌也具有很高的灵敏度。然而，该方法依赖于培养基和培养条件，并且仅限于可培养的细菌，这使得存活但不可培养（VBNC）菌株无法被检测。另一个主要缺点是该方法通常需要数天时间才能得到结果，而这些结果也只是估算值。一块菌落可能来源于一个细胞，也可能来源于上千个细胞。此外，样本制备过程因技术人员的操作差异以及样本条件的不同而可能存在变动。对于诸如食品或水污染等需要快速响应的时效性问题而言，这种耗时的特点是一个显著的缺陷。

1.2 血球计数板法

采用Petroff-Hausser或Levy等专用计数板直接显微计数，这种细胞计数的“金标准"是一种相对快速、简单的方法，可获得结果。然而，该方法操作繁琐，并且容易受到操作者之间差异的影响。细菌体积微小，不仅某些物种即使在显微镜下难以观察，同时还会导致细菌在计数腔内移动，并分布于不同的焦平面上，从而难以评估和控制每次细胞复制时计数的准确性。

1.3 流式细胞仪

流式细胞仪被认为是确定总细胞数和活细胞数最为准确的方法之一。然而，这种方法中操作仪器和分析数据都需要广泛的培训。与菌落计数类似，流式细胞仪的一个显著局限性是无法区分单个细胞和细胞团。每个粒子均记录为单一事件，因此，聚集的球菌或链状的杆菌无法被识别为单个细胞。

1.4 QUANTOM Tx™微生物细胞计数仪

QUANTOM Tx微生物细胞计数仪是一款基于图像的自动化细胞计数设备，能够在数分钟内识别并计数单个细菌细胞。QUANTOM Tx可自动对荧光染色的细胞进行聚焦、成像和多图像分析，以高灵敏度和高精确度检测细菌细胞。其先进的细胞检测与解聚算法，即使在最紧密的细胞聚集体中，也能准确识别单个细菌细胞。通过使用两种不同的染料，QUANTOM Tx可以分别计数总细胞数或活细胞数。染色后的细胞与QUANTOM细胞加载缓冲液I混合后，被加载到QUANTOM M50细胞计数载片中，并使用QUANTOM离心机进行离心处理，从而将细胞固定并均匀分布在单一焦平面上，确保精确的细胞检测。计数结果和图像可在计数完成后立即查看和保存。

用QUANTOM Tx™微生物细胞计数仪计数

2 QUANTOM Tx对标准微球计数的精准测定

通过计数已知浓度的标准荧光微球，验证了QUANTOM Tx的计数准确性。实验中，微球经系列稀释后与QUANTOM细胞加载缓冲液I混合，并加载到QUANTOM M50细胞计数载片中。载片在QUANTOM离心机中以300×g（RCF）离心10分钟，以确保微球均匀分布，随后使用以下参数在QUANTOM Tx上进行计数：LED设置为“Bead（微球）"、粒径范围为1-50μm、检测灵敏度为0、解聚等级为7、圆度为30%。所有计数均进行了三次重复。正如图1所示，QUANTOM Tx的计数结果与微球的理论浓度呈现出高度相关性（R² = 0.9997）。

图1. 已知标准微球浓度与QUANTOM Tx结果之间的相关性

3 与流式细胞仪和血球计数板的准确性及变异性比较

为了比较QUANTOM Tx与流式细胞仪和血球计数板的计数准确性，对大肠杆菌进行了三次重复的系列稀释计数。对于流式细胞仪，使用噻唑橙（Thiazol Orange）对细胞进行染色，并使用FACSCalibur流式细胞仪（BD Biosciences）进行计数，同时加入标准微球以帮助确定细胞浓度。对于血球计数板，细胞被加载到Petroff-Hausser计数板（20 μm，Hausser Scientific）中，并通过CELENA S数字成像系统（Logos Biosystems）使用TC PlanAchro 20倍物镜进行成像，计数了Neubauer计数网格中的五个小格。对于QUANTOM Tx，细胞使用QUANTOM总染色染料进行染色，并使用以下参数进行计数：LED强度=5，粒径范围=0.3-50 μm，检测灵敏度=0，解聚等级=0，圆度=0%。结果显示，总细胞浓度的计数结果之间没有显著差异，但随着细胞浓度的增加，血球计数板的计数结果变异性较高，而QUANTOM Tx和流式细胞仪的结果则更加一致（图2）。

图2. QUANTOM Tx、流式细胞仪和血球计数板的计数结果比较。

4 可调节的检测方案适用于各种形态和排列方式的细菌细胞

为了展示QUANTOM Tx的多功能性，不同种类的细菌使用QUANTOM总染色染料进行染色，并通过QUANTOM Tx进行计数。QUANTOM Tx能够在每次计数中自动捕获、分析并标注多达20张高分辨率图像，使得研究人员可以轻松地通过视觉验证每次计数的准确性。以干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）为例，使用以下参数进行计数：LED强度=5，粒径范围=1-50 μm，检测灵敏度=0，解聚等级=7，圆度=0。对于巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium），使用的参数为：LED强度=5，粒径范围=1-50 μm，检测灵敏度=3，解聚等级=10，圆度=0。更多细菌种类及其对应的参数设置可参见：goo.gl/ixr8kr。如图3所示，QUANTOM Tx利用解聚功能能够在紧密排列的杆菌链中精准分辨出单个细胞。

图3. 使用QUANTOM Tx的解聚功能检测杆菌链中的单个细胞。左图为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei），右图为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium），解聚等级分别设置为7和10。

5 结论

细菌是一类极其多样化的生物，具有多种多样的形态、大小和排列方式，这使得自动化细胞计数成为一项充满挑战的任务。传统的菌落计数方法不仅耗时，而且其结果充其量只能算作一种不可靠的估算。即使是流式细胞仪，也会将每个粒子（无论是单个细胞还是聚集体）都记录为一个单独的事件。血球计数板操作耗时，并且容易受到操作者间变异的影响。QUANTOM Tx微生物细胞计数仪能够高效、准确且快速地对各种形态和排列方式的细菌进行定量分析。这使得QUANTOM Tx成为一种重要且必需的工具，可用于样本中细菌群体的即时、实时评估。

使用QUANTOM Tx测试的部分细菌列表