点成案例 | 通过LUNA-FX7™自动聚焦算法提升低浓度细胞计数的精确性

1 引言

现代细胞计数仪采用自动化方法对特定浓度范围内的细胞进行计数。高浓度的上限受限于准确区分细胞边界的能力，而低浓度的下限则由摄像头视场（FOV）等因素决定。然而，当图像中只有少量可辨别的细胞或特征时，自动聚焦失败可能会影响细胞计数性能，导致较高的变异系数（CV）。在细胞浓度足够的常规细胞培养过程中，这通常是一个次要问题，但在如细胞治疗产品制造初期种子培养阶段的极低浓度样本中，这一问题则显得尤为关键。在此类情况下，获得清晰图像对于实现准确细胞计数至关重要。为了解决这一问题，我们开发了一种新型自动聚焦算法，通过先进技术精确识别图像特征。本技术说明讨论了LUNA-FX7™软件（1.9.1及以上版本）中针对极低浓度优化的最新更新，同时展示了LUNA-FX7™自动细胞计数仪的性能。

2 LUNA-FX7™的自动聚焦过程

LUNA-FX7™系统采用基于图像对比度的自动聚焦算法。该自动聚焦过程由粗略扫描和精细扫描组成，确保LUNA-FX7™系统的最佳聚焦性能（图1）。其首先通过粗略扫描在广泛的Z平面范围内采集图像，以覆盖较大的景深。在此过程中，算法确定一个大致的焦平面。随后，进行精细扫描，专注于更窄的Z平面范围，精确确定最佳焦平面。此过程基于图像特征，保证了LUNA-FX7™系统的最佳聚焦性能。

图1. 图示LUNA-FX7™系统自动聚焦过程的工作流程，包括粗略扫描和精细扫描

自动聚焦的挑战

依赖图像对比度的自动聚焦算法在仅有少量目标物体或特征较少的情况下，可能难以准确确定适合的聚焦位置。在粗略扫描阶段，这一问题尤为明显，系统可能难以识别合适的Z平面，导致后续精细扫描中聚焦失败（图2A）。为了解决这些挑战，我们开发了一种新算法，以增强在低细胞浓度或图像特征有限条件下的目标物体识别能力（图2B）。该改进算法提高了自动聚焦过程的精确性和可靠性，在复杂场景中提供更精确和一致的结果。

图2. 不同算法在聚焦中的表现。(A) 算法1未能找到焦点，导致图像模糊不清 (B) 算法2成功识别合适的聚焦位置，图像清晰锐利

改进的自动聚焦性能

为验证新开发的自动聚焦算法的有效性，我们通过使用相同样本对LUNA-FX7™系统的不同软件版本进行了对比实验。结果证实，新自动聚焦算法的性能有显著提升。这一显著改进通过采用组合方法增强了目标检测的灵敏度，实现了所有视场中更精确和可靠的聚焦位置（图3）。即使在每张图像中目标物体少于五个的极低细胞浓度下，升级后的算法仍能实现精确的聚焦位置，表现出一致的准确性。

图3. 将U937细胞稀释至2.54 x 10⁴细胞/mL的浓度，使每张图像中目标物体少于5个。显示完整的12个视场。算法2能有效检测和识别目标物体(A)，而算法1未能实现理想聚焦(B)

结论

LUNA-FX7™系统在极低细胞浓度下提供了准确的细胞计数。通过采用增强目标检测灵敏度的组合方法，我们改进的自动聚焦算法显著提升了性能。在目标物体或特征有限的情况下，该算法能够准确识别聚焦位置。这些改进使LUNA-FX7™系统在复杂条件下成为可靠且高效的细胞计数解决方案。新型自动聚焦算法已应用于LUNA-FX7™ 1.9.1版本及以上的软件中。